Оценка безопасности воды для инъекций с использованием LAL-теста

Приходько А.Е. (ЗАО «НПК Медиана - Фильтр»)

Вода в фармацевтическом производстве относится к ключевым элементам, обеспечивающим безопасность изготавливаемых лекарственных средств. Без применения воды самого разного качества не обходится практически ни одно фармацевтическое предприятие. Она может использоваться как сырье, вспомогательный материал, а так же как энергоноситель.

В технологическом процессе изготовления лекарственных средств, особенно для парентерального применения, вода занимает одно из первых мест среди основных источников пирогенных веществ, химического, микробиологического загрязнения, поэтому важной задачей является обеспечение высокого качества воды для фармацевтических целей, что достигается оптимальным выбором системы водоподготовки.

При производстве лекарственных средств для парентерального применения необходимо использовать воду для инъекций, к которой предъявляются достаточно жесткие требования. Одно из них - отсутствие пирогенных веществ.

Получить апирогенный продукт, а это - одно из основных требований, предъявляемым к инъекционным препаратам, можно лишь при правильной организации всего технологического процесса получения лекарства, в частности, контроля на содержание пирогенов. Наиболее рациональные точки контроля при изготовлении парентеральных лекарственных средств следующие: контроль сырья, контроль воды для инъекций , проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов, контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием, контроль чистоты ампул, флаконов. Основными источниками пирогенных веществ в воде для инъекций являются системы умягчения воды, деионизации и угольный фильтр, которые требуют наиболее пристального внимания, частой регенерации, очистке и т.п.

Требование апирогенности воды для инъекций связано с возможностью возникновения пирогенной реакции, которая выражается повышеним температуры тела, ознобом и другими симптомами. Причиной такой реакции часто являются эндотоксины граммотрицательных бактерий, которые при внутривенном введении обладают значительно большей активностью, чем при подкожном или внутримышечном введении. В связи с этим особенно опасны инфузионные растворы, загрязненные бактериальными эндотоксинами, т.к. они вводятся человеку в больших объемах.

Согласно ГФ XI тест на пирогенность проводится биологическим методом на кроликах, основанным на измерение температуры тела животных после внутривенного введения испытуемого препарата. Использование млекопитающих, вида, близкого к человеку, позволяет установить влияние испытуемого препарата на целый организм. С помощью испытания на животных возможно определять действие обоих классов пирогенов – «экзо» и «эндо»-токсинов, а также пирогенов небактериальной природы.

Однако этот метод достаточно длителен (4-5 часов), дает значительную вариабельность результатов, связанную с индивидуальной чувствительностью (чувствительность животных в 3-4 раза ниже, чем у человека), сезонностью. Используемые в эксперименте животные, должны содержаться в строго определенных условиях. Кроме того, многие лекарственные вещества в дозах, близких к терапевтическим, могут вызвать токсические реакции и даже гибель животных.

Наряду с фармакопейным методом возможно использование люминесцентного метода, основанного на способности бактериальных эндотоксинов усиливать флуоресценцию родамина 6Ж и 1-анилина-нафталин-8-сульфоната; флуориметрического метода, основанного на измерении собственной интегральной флуоресценции бактериальных пирогенов в пределах длин волн эмиссии от 310 до 400 нм.

В настоящее время доминирующее значение для контроля за содержанием пирогенных примесей, а именно, бактериальных эндотоксинов (БЭ), получил LAL -тест, позволяющий проводить испытания in vitro . Этот метод основан на способности лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами граммотрицательных бактерий. В результате реакции происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина. Этот метод широко используется за рубежом и в настоящее время внедряется в России. Основными преимуществами LAL- теста являются:

  • Возможность оценить уровень БЭ в тех препаратах, которые невозможно проверить на животных (антипиретиков, радиофармацевтических, противоопухолевых, седативных, короткоживущих изотопов и др.);
  • Чувствительность LAL -теста в 100 раз выше, нежели чем испытание пирогенности традиционным методом;
  • С помощью LAL- теста можно количественно определить концентрацию БЭ до 0,03 ЕДэ /мл (с помощью опытов на животных удается выявить наличие пирогенов, содержание которых превышает 5-10 ЕДэ / мл);
  • Быстрота выполнения LAL -теста – 1- 1,5 часа.

Этот метод введен в Американскую, Британскую, Европейскую и др. Фармакопеи. В 1997 году Фармакопейный Государственный Комитет РФ утвердил общую фармакопейную статью 42-2960-97 «Определение содержания бактериальных эндотоксинов («ЛАЛ-тест»)».

Быстрота выполнения и высокая чувствительность LAL -теста в первую очередь необходимы для анализов воды, которую получают на асептических участках фармацевтических предприятий и применяют в качестве растворителя для приготовления парентеральных лекарственных средств. В настоящее время контроль безопасности, качества воды осуществляется в опытах на кроликах. Замена этого трудоемкого и малочувствительного метода даст не только экономический эффект, но и значительно улучшит качество лекарственных препаратов, и соответственно, безопасность их применения.

Для оценки безопасности и качества воды для инъекций , получаемой на фармацевтических предприятиях и в аптеках, в частных статьях Фармакопей США, Европы установлен показатель «содержание бактериальных эндотоксинов», который не должен превышать 0,25 ЕДэ/мл . В данный момент в нашей стране утверждается изменение к частной фармакопейной статье 42-2620-97 «Вода для инъекций». Для оценки пирогенности, как альтернативный биологическому, предлагается LAL -тест для определения содержания БЭ (не более 0,25 ЕДэ/мл).

На многих предприятиях в США, Европе, Японии и др., занятых выпуском парентеральных препаратов, существуют собственные стандарты, регламентирующие содержание БЭ в воде для инъекций. Они значительно строже, чем требуемый предел 0,25 ЕДэ/мл (табл.1):

табл.1

Пределы содержания БЭ в воде для инъекций

УРОВЕНЬ

« ALERT LIMIT »

« ACTION LIMIT »

LAL -тест (гель-тромб тест)

0,03 ЕДэ / мл

0,125 ЕДэ / мл

« ALERT LIMIT » - уровень содержания БЭ, при котором должно быть повышенным внимание к качеству получаемой воды, системе водоподготовки и другим фактором, которые могли бы изменить данный показатель;

« ACTION LIMIT » - уровень содержания БЭ, при котором должно быть приостановлено получение воды для инъекций и приняты необходимые меры для устранения причин высокого содержания БЭ (замена мембран, регенерация колонок, санитарная обработка систем водоподготовки, распределения и т.п.).

Такие требования (из табл.1 мы видим, что в идеале, получаемая вода должна содержать менее 0,03 ЕДэ/мл) гарантируют безопасность и качество получаемой воды для инъекций по показателю «бактериальные эндотоксины».

Апирогенность является одним из показателей безопасности воды для инъекций. Поэтому целью работы явилось исследование с помощью LAL -теста образцов воды, полученных на различных стадиях водоподготовки, и оценка влияния каждой из стадий на показатель «пирогенность». На анализ была отобрана вода, получаемая в межбольничных аптеках с различными системами водоподготовки.

Пример 1. Система водоподготовки состоит из следующих стадий:

Содержание бактериальных эндотоксинов (ЕДэ/мл)

1

2

3

4

5

6

> 1 ,00

0,25

<0,06

<0,03

Установлено, что в питьевой воде (1), воде после умягчения (2) и угольного фильтра (3) содержание бактериальных эндотоксинов составляло более 1 ЕДэ/мл. После стадии обратного осмоса (4) – 0,25 Едэ/л, что соответствует требованиям Американской и Европейской Фармакопей (в воде для инъекций содержание бактериальных эндотоксинов должно быть не более 0,25 ЕДэ/мл). После УФ-облучения (5) и дистилляции (6) содержание бактериальных эндотоксинов было в 4-8 раз ниже требуемой нормы.

Пример 2. Воду для инъекций получают путем бидистилляции.

Содержание бактериальных эндотоксинов (ЕДэ/мл)
Питьевая вода

Вода после бидистилляции

>2,00

<0,06

Установлено, что в питьевой воде содержание БЭ превышает 2,00 ЕДэ/мл. Вода после бидистилляции содержит менее 0,06 ЕДэ/мл.

Пример 3. Воду для инъекций получают дистилляцией.

Содержание бактериальных эндотоксинов (ЕДэ/мл)
Питьевая вода

Вода после дистилляции

>2,00

<0,125

Установлено, что питьевая вода содержала более 2,00 ЕДэ/мл, в воде после дистилляции – менее 0,125 ЕДэ/мл.

Таким образом, полученные результаты показали, что для получения воды для инъекций требуемого качества по показателю «пирогенность» необходима достаточно сложная система водоподготовки.

Выводы:

  • Показано, что LAL -тест является высокоэффективным и производительным методом в оценке качества и безопасности воды для инъекций.
  • Использование LAL -теста позволяет оценить и выбрать оптимальную схему водоподготовки, обеспечивающей качество воды для инъекций по показателю «пирогенность».
(c) 2010 НПК "Медиана - фильтр"
Все права защищены.